研究背景

據美國癌癥協會統計，乳腺癌仍是美國女性中最常被診斷和與死亡相關的癌癥之一。2012年，美國約226,870名女性被診斷出患有乳腺癌，占所有新診斷的女性癌癥患者的29％。據估計，在過去的一年中，乳腺癌在美國導致39,000多人死亡，是婦女第二大導致癌癥死亡的原因。早期診斷可以顯著提高乳腺癌的長期生存率。目前，乳腺X射線攝影術是檢測乳腺癌的最可接受和最有效的篩查程序，并被美國預防服務工作隊（USPSTF）推薦給40歲以上的女性。但是，由于該篩查的假陽性率高，USPSTF于2009年將其建議修改為降低乳腺X線篩查的頻率。其他成像技術，例如超聲檢查和磁共振成像，也已用于乳腺癌篩查。不幸的是，即使包括了這些成像技術，仍約20％的乳腺癌患者無法被檢測到。血漿（或血清）生物標志物（例如抗原和蛋白質模式）很有前景；但它們仍然離臨床使用還很遠。一些腫瘤標志物，例如CA15.3和CA27.29，僅建議用于治療性監測，而不建議進行篩查。因此，迫切需要可以單獨使用或與其他現有方法結合使用的新型有效的乳腺癌篩查生物標志物。

除了遺傳和蛋白質組學變異之外，與正常細胞相比，癌細胞已顯示出不同的代謝變異?；谫|譜（MS）和核磁共振（NMR）的先進代謝技術已經在尋找癌細胞和臨床樣品。為了支持癌細胞的快速增殖，脂肪形成的增加被認為是許多類型癌細胞的代謝特征。各種研究中還報道了血漿（或血清）脂質（例如總膽固醇，高密度脂蛋白和甘油三酸酯）與乳腺癌風險之間的關聯。使用MS的先進分析技術可以對給定的生物樣本中的數百種脂質進行靶向分析和同時定量。最近報道了基于MS的乳腺癌組織中不同脂質組成與正常組織水平相比的分析結果，揭示了脂質代謝（如PC（磷脂酰膽堿）（14：0/16：0）水平）與脂質代謝之間的高度相關性。腫瘤等級或雌激素受體的狀態。作者假設腫瘤組織中脂質表達的變化將導致乳腺癌患者血漿中獨特的脂質譜，這可以通過靶向和定量代謝組學方法進行檢測。檢測到的區分血漿脂質可用作乳腺癌早期篩查的新生物標記。

在本研究中，作者使用定量和靶向代謝組學方法結合電噴霧電離串聯質譜（ESI-MS / MS）分析了55名乳腺癌患者和25名健康對照的血漿樣品。這項研究的目的是確定潛在的診斷性生物標志物，并增進對乳腺癌脂質代謝的了解。

實驗部分

樣品信息

從希望之城綜合癌癥中心收集了總共53例乳腺癌患者和25例健康對照。為了避免乳腺癌（BC）患者和健康對照之間的年齡差異的影響，將樣本分為訓練組和測試組。在訓練組中，乳腺癌組（30名受試者）的平均年齡為41.3（25-56歲），健康對照組（20名受試者）的平均年齡為38.2（28-40歲），兩者之間的年齡無顯著差異組（p = 0.111）。表2提供了更詳細的信息。為了避免食物的影響，早餐前要采集所有血液樣本。

樣品處理和代謝物分析

作者的目標代謝組學方法基于使用AbsoluteIDQTM p180試劑盒的電噴霧電離質譜（ESI-MS / MS）測量。該試劑盒可同時定量40個?；鈮A，90個甘油磷脂（14個溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿），15個鞘脂和1個己糖。

實驗結果

多元分析

本研究共分析了146種代謝物。對這些代謝物，首先對訓練數據集進行主成分分析（PCA）。觀察到樣品組之間的分離情況，大多數健康對照散布在圖的頂部，而大多數乳腺癌樣品散布在圖的下半部（圖1）。PCA模型揭示了乳腺癌患者和健康對照之間的一般代謝信息。為了進一步說明與癌癥發病率相關的代謝變化，建立了具有一個預測分量和兩個正交分量的監督正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型。如圖2A所示，在得分圖中獲得了清晰的分離，所有乳腺癌患者在左半部分，健康對照者在右半部分。為了進一步驗證已建立的模型，對相應模型執行了999次置換測試。結果表明，置換試驗中所有R2和Q2值均低于原始值。該?Q2的軸截距小于零（Q2截距（0，-0.295））。這些結果驗證了當前的PCA模型。

圖1. 主成分分析（PCA）圖

圖2. 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）得分圖和置換檢驗

代謝物鑒定

基于OPLS-DA模型中預測（VIP）值的可變重要性，選擇了VIP> 1的46 種代謝物。還使用Student t檢驗進行了單變量分析，以選擇不同的代謝物。用經典的一階段方法進行錯誤發現率（FDR）測試后，選擇了39種代謝物，調整后的p值均小于0.05（表1）。這39種差異化代謝產物包括10個溶血磷脂酰膽堿（lysoPC），23個甘油磷酸膽堿（PC，9個PCAas和14個PC Aes），5個鞘磷脂（SM）和1個?；鈮A。作者們進一步比較了體重指數（BMI）<25（n）的乳腺癌患者中這39種差異化代謝產物的濃度。在t檢驗中，體重正常的患者和肥胖的受試者在這39種代謝物中只有5種顯著不同。這五個代謝物被排除在作者們的診斷方程之外。FDR調整后，沒有代謝物顯示出顯著差異，q值低于0.05。

表1. 乳腺癌患者和健康對照之間的代謝物差異

診斷方程

為了建立從健康對照中識別乳腺癌患者的簡單診斷方程式，將從訓練數據集中選擇的39種分化代謝物輸入SPSS以進行邏輯回歸。結果表明，三種代謝物（lysoPC a C16：0，PC ae C42：5和PC aa C34：2）的濃度顯著影響乳腺癌患者和健康對照組之間的診斷結果。利用這三種代謝物的濃度，建立了y = lysoPC a C16：0×1.034 + PC ae C42：5×44.248-PC aa C34：2×0.585-37.002 的診斷方程。計算每個樣本的Y值（在訓練和驗證數據集中）。散點圖顯示，幾乎所有的?從乳腺癌樣本獲得的-值低于零，而來自健康對照的y值高于零（驗證數據集中的一個乳腺癌樣本和一個健康對照除外，圖3），靈敏度為98.1％，特異性為96.0％，陽性預測值為98.1％，陰性預測值為96.0％。

圖3. 散點圖

由于驗證數據集中乳腺癌組的年齡差異較大，因此對年輕乳腺癌患者和老年乳腺癌患者中這三種代謝物的濃度進行了分析。結果顯示年齡在41歲以下（n= 17）的乳腺癌患者與乳腺癌患者之間的這三種代謝產物（lysoPC a C16：0，PC ae C42：5和PC aa C34：2）無顯著差異。年齡超過60歲（n= 12）。此外，對于年齡小于50歲（n= 29）和年齡大于50歲（n= 24）的患者，這三種代謝物均未觀察到顯著差異。因此，年齡并不是這三種代謝物的混雜因素。

磷脂酰膽堿

甘油磷脂包含脂質代謝物的兩個亞類，PC二酰基（PC aa）和PC?；榛≒C ae）。總共選擇了23種甘油磷脂作為區分代謝物（表2），其中大多數在乳腺癌患者的血漿中較低。在所有磷脂酰膽堿中，檢測到PC ae 40：3是脂質中統計學上最顯著的下降（p值為2.79×10 -10）。乳腺癌患者血漿樣品中甘油磷脂的減少可能反映了磷脂酶A2（PLA2）的較高活性，這是一種酶家族，可將甘油磷脂水解為lysoPC和脂肪酸。

表2. 受試者的臨床信息和特征

以前的研究表明，PLA 2的表達在癌癥患者中被上調。PLA 2的活性中觀察到如在侵入性乳腺癌腫瘤組織比良性乳腺腫瘤組織和正常乳腺組織顯著更高。PLA 2是一個酶家族，在不同組織中表達的異構體不同。

PLA 2可以通過多種機制參與癌癥的發展。它可能通過釋放lysoPCs介導癌變，通過其代謝成溶血磷脂酸誘導細胞生長。一些脂肪酸，尤其是花生四烯酸也被釋放并代謝成幾個分子，其中許多可能誘導細胞生長和增殖。在該研究中，乳腺癌患者血漿樣品中大多數lysoPCs的濃度均顯著降低，表明花生四烯酸代謝可能是乳腺癌發展的主要因素。此外，PLA 2可能會產生炎癥介質，從而促進腫瘤形成。

溶血磷脂酰膽堿

LysoPCs來源于磷脂酶對甘油磷脂的部分水解作用。在乳腺癌患者和健康對照之間鑒定出的差異代謝產物中，有10種選定的代謝產物是lysoPC。與健康對照相比，在乳腺癌患者中檢測到的差異化溶酶PCs濃度較低。溶血PC一個C16：0和溶血PC一個C18：0被確定為具有最低的頂部的兩個微分代謝物p-值（1.21×10 -13為溶血PC一個C16：0和4.21×10 -13對于lysoPC而言，在所有39種差異化代謝產物中均為C18：0）。有趣的是，據報道，從乳腺癌組織樣本中提取的磷脂酰膽堿硬脂酸（C18：0）在那些已發生轉移的患者中明顯較低，甚至被認為是乳腺癌預后的獨立腫瘤內標志物。據報道，lysoPC a C16：0和lysoPC a C18：0的降低與肝細胞癌組織中PC的降低有關。

這兩個lysoPC（lysoPC a C 16：0和lysoPC a C18：0）是血漿中最豐富的lysoPC。兩種lysoPCs水平的降低將在很大程度上降低血漿中總lysoPCs的濃度，以前據報道這與癌癥患者的激活的炎癥狀態有關。實際上，在乳腺癌患者中發現血漿總lysoPCs（當前研究中檢測到的所有14種lysoPCs的濃度之和）顯著降低（p= 6.87×10 -8，倍數變化（FC）= ?1.67，乳腺癌為健康對照）。lysoPC a C 20：4的平均濃度顯示出從I期到IV期乳腺癌患者的下降趨勢（I期為9.22±3.62μM，II期為8.64±2.20μM，III期為8.37±3.20μM，而7.87±階段IV為2.50μM）。那些lysoPC包含非常長的鏈脂肪酸，例如lysoPC a C24：0，lysoPC a C26：0和lysoPC a C28：0，在乳腺癌患者中其含量也顯著降低。溶血磷脂酶可被溶血磷脂酶代謝，并進一步代謝為脂肪酸和膽堿。較低的lysoPCs水平可能反映了乳腺癌患者的新陳代謝率較高。據報道，自分泌運動蛋白（一種分泌的溶血磷脂酶D）可增強腫瘤細胞的運動能力，存活率和增殖能力。實際上，據報道，自分泌運動蛋白和溶血磷脂酸的表達有助于小鼠模型中乳腺癌的發生和發展。

肉毒堿

與健康對照相比，乳腺癌患者血漿樣品中甘油磷脂的較高水解速率與較高水平的?；鈮A相關。在這項研究中，?；鈮AC4被選作差異代謝產物。此外，在乳腺癌患者中檢出了更高濃度的其他幾種?；鈮A（例如?；鈮AC18，C18：2，C3和C5），p值低于0.05（C18 p = 0.034，C18：2 p = 0.037，p18 = 0.037）。 C3和C5均為0.015）。增加的酰基肉堿濃度表示高級脂肪酸β-氧化的乳腺癌患者，這與最近的研究，其指示脂解和脂質氧化在癌細胞[被上調一致]。脂肪酸可以通過β-氧化來消耗，從而為癌細胞的生存提供關鍵的替代能量。在某些類型的癌癥中，例如前列腺癌，脂肪酸氧化被認為是主要的生物能途徑。在腎癌患者和癌癥高級別患者中也觀察到幾種酰基肉堿濃度的升高，這表明?；鈮A濃度可能是癌癥狀態和腫瘤級別的有前途的標志。

神經鞘磷脂

包括SM（OH）C22：2，SM（OH）C14：1，SM（OH）C16：1，SM（OH）C22：1和SM C20：2在內的所有五個區分鞘磷脂（SM）在乳腺癌患者中的水平。SM是細胞膜的豐富組成部分，并且優先集中在大多數哺乳動物細胞的質膜的外部小葉中。SM通過SM循環在調節細胞生長和分化中起著重要作用。一些信號代謝物，例如神經酰胺，鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇，參與了該循環。許多研究表明，神經酰胺是癌細胞對FAS / FAS配體，腫瘤壞死因子-α（TNFα），生長因子戒斷，缺氧，高熱和DNA損傷等誘導細胞凋亡的重要信號分子。實際上，與鄰近的正常組織相比，在乳腺癌組織中檢測到更高水平的神經酰胺合酶和神經酰胺。S1P是另一種衍生自SM的生物活性脂質，據報道可通過細胞內和受體介導的機制調節癌細胞的生長，存活和遷移。SM循環水平增加的結果可能表明乳腺癌患者SM循環功能異常，這可能調節癌細胞的生長和轉移。

在乳腺癌的早期階段，檢測到某些SM的濃度較高，例如SM（OH）C22：1，SM（OH）C22：2，SM（OH）C24：1和SM C26：0。顯示出從I期到IV期乳腺癌患者的持續減少（圖4）。SM（OH）C22：1，SM（OH）C24：1和SM C26：0僅在患有早期癌癥的乳腺癌患者中顯著升高，但不是在乳腺癌患者在晚期階段（階段III和IV期）。這些結果表明，某些SMs標記物在早期患者中受到的影響更大。與早期患者相比，晚期患者中這些SMs降低的潛在機制尚待闡明。

圖4. 四種特征性鞘磷脂的條形圖

結論

在該項研究中，作者使用靶向和定量代謝組學方法分析了53名乳腺癌患者和25名健康對照的血漿樣品中的一組脂質。OPLS-DA模型使用由30位患者和20位健康對照組成的訓練數據集顯示出乳腺癌患者與健康對照之間脂質譜的明顯區別，并成功預測了與驗證數據集中的控件。在乳腺癌患者中，所選擇的差異代謝物（包括39種脂質）顯示出較低的溶血磷脂酰膽堿水平和較高的鞘磷脂和酰基肉堿水平。建立了使用三種代謝物（lysoPC a C16：0，PC ae C42：5和PC aa C34：2）的診斷方程，該方程成功地將乳腺癌患者與健康對照組分離，靈敏度為98.1％，特異性為96.0％。當前研究的局限性在于樣本量相對較小，尤其是對于驗證數據集中的健康對照。