]服務簡介
表觀組學測序（Epigenomics Sequencing）是以高通量測序平臺為基礎，研究基因表達及調控的可遺傳變化的技術。根據研究內容可將表觀組學分為兩類：DNA/RNA的化學修飾和DNA/RNA與蛋白質相互作用。常用的表觀遺傳學測序方法包括BS-seq和ChIP-seq。
全基因組DNA甲基化測序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）是將重亞硫酸鹽處理方法和Illumina高通量測序平臺相結合，對有參考基因組的物種在全基因組水平進行高精準甲基化研究。WGBS可以達到單堿基分辨率，精確分析每一個胞嘧啶的甲基化狀態，從而構建精細的全基因組DNA甲基化圖譜。
ChIP-Seq是將染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）與二代測序相結合的表觀遺傳研究技術，能夠高效地在全基因組范圍內對DNA和蛋白的相互作用進行檢測，通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。
RIP-seq是研究細胞內RNA與蛋白結合情況，以RNA免疫共沉淀（RIP）為基礎，采用特異抗體對RNA結合蛋白或者特殊修飾的RNA進行免疫共沉淀后，分離RNA，通過Illumina測序，在全轉錄組范圍內研究被特定蛋白特異結合的RNA區域或種類，且可比較多個樣品間差異。
]服務優勢
◆定制化分析策略：根據不同測序方案和測序目標，定制化選擇比對算法、Peak Calling算法以及注釋用數據庫區域信息。
◆ 高深度、高靈敏度：對低頻甲基化位點的探測率高，對甲基化和非甲基化均等捕獲；單堿基分辨率，可精準檢測每個胞嘧啶的甲基化狀態。
◆低成本、高效率：使用液體捕獲技術，精準獲得全基因組甲基化的C位點，大大提高捕獲效率；同時靶標區域的選擇策略可降低成本，得以實現多樣本快速實驗。
◆強大的組學聯合分析能力：將ChIP-Seq與甲基化測序、轉錄組測序以及全基因組測序等技術進行結合，將單一的蛋白結合數據更進一步拓展。
◆定制化信息分析：針對不同平臺的數據，結合客戶的需求，靈活進行定制化信息分析。
◆完善的售前售后服務：經驗豐富的技術支持和生物信息工程師提供研究策略指導及完善的售后服務。
]服務項目
甲基化測序
RRBS
Chip-Seq
RIP/DIP-Seq
]服務流程
]樣本量要求
樣本類型 | 樣本量及樣本要求 |
動物和各類組織樣本 | ≥50mg |
植物組織樣本 | ≥50mg |
DNA樣本 | DNA總量≥50ng 樣本濃度≥100ng/uL 樣品純度OD260/280為1.8~2.2 DNA主帶清晰無明顯降解 |
]甲基化測序技術參數
檢測平臺：基因組甲基化測序采用先進的Illumina測序平臺，快速、高效地讀取高質量的測序數據。
測序深度：PE 150
服務周期：90天
]RIP-seq技術參數
檢測平臺：通過Illumina測序，在全轉錄組范圍內研究被特定蛋白特異結合的RNA區域或種類，且可比較多個樣品間差異。
測序深度：PE 150 / SE 50
服務周期：60天
]服務內容
1.甲基化測序服務內容：
測序數據質量評估、與參考基因組比對、甲基化位點calling、甲基化分布、差異甲基化分析、相關基因分析、多樣本分析。
2.RIP-seq服務內容：
測序數據質量評估、與參考基因組比對、peak峰calling、樣品間相關性分析、motif分析、peak峰相關基因注釋、差異peak分析、相關基因功能分析。
MAPQ (Mapping Quality)，即比對質量值，表示reads比對到參考序列上某個位置的可靠程度，用錯誤比對到該位置的概率值來表示： MAPQ = -10log10(P)，P是錯誤比對的概率。這里的錯誤比對，我們粗略的認為是非唯一比對。MAPQ越小，說明reads比對到該位置上的錯誤率越高。
圖1 比對質量分布圖
樣品間相關性分析是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。相關系數越接近1，表明樣品之間RNA甲基化模式的相似度越高。
圖2 樣品間相關性檢查
對于單端測序，我們采用MACS2軟件預測IP實驗的片段大?。ú迦肫危?。MACS以某個window size掃描基因組，統計每個window中read的富集程度，然后抽取1000個合適的window作樣本構建富集模型，預測插入片段的長度。 對于雙端測序，我們采用RSeQC軟件對比對結果進行插入片段預測。利用預測得到的插入片段進行后續的peak分析。
圖3 插入片段長度分布圖
隨著新一代測序技術的發展，將m6A抗體富集后的RNA序列直接進行高通量測序，利用MACS2軟件（(閾值為qvalue=0.05)完成峰檢分析（peak calling）并進行峰的個數、 寬度、分布等進行統計，以及篩選出峰的相關基因。
圖4 峰在染色體上的分布 圖5 峰的寬度分布
作為mRNA中最常見的甲基化修飾，m6A主要富集在mRNA的啟動?子區、終?止密碼子區，并且有特定的結合序列，通過結合到特定的位置上，從而在基因表達調控中發揮作用。我們利HOMER軟件對MeRIP peak結合的mRNA區域上進行了motif (motif表示m6A位點的序列保守性)的識別。
圖6 motif序列
Peak 重疊基因GO富集柱狀圖，直觀的反映出在生物過程(biological process)、 細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO項目上Peak 重疊基因的個數分布情況。
圖7 GO富集分析
Peak 重疊基因KEGG富集散點圖是KEGG富集分析結果的圖形化展示方式。KEGG富集程度通過Rich factor、qvalue和富集到此通路上的基因個數來衡量。
圖8 KEGG富集散點圖
相關文獻
Xu J, Zhou S, Gong X, et al. Single-base methylome analysis reveals dynamic epigenomic differences associated with water deficit in apple. Plant Biotechnol J. 2018;16(2):672-687.
