]服務簡介
微生物群落（菌群多樣性組成譜）測序是指以細菌/古菌16S rRNA基因可變區、真菌18S rRNA基因可變區或真菌ITS（Internal transcribed spacer）內轉錄間隔區等微生物特征序列（Signature sequence）為靶點對微生物群體進行高通量測序，通過分析測序序列的結構（數量、豐度、種類、變異等）來分析特定環境中微生物群體中各類微生物的構成情況或其功能。繼而我們可以研究分析微生物與環境因素或宿主之間的關系，尋找標志性菌群或特定功能的基因，闡明樣本間多樣性和組成差異，進而發現差異相關物種。
對微生物群落進行測序包括兩類：
1. 通過16s rDNA，18s rDNA，ITS區域進行擴增測序分析微生物的群體構成和多樣性；
2. 宏基因組測序，是不經過分離培養微生物，而對所有微生物DNA進行測序，從而分析微生物群落構成，基因構成，挖掘有應用價值的基因資源。
以16s rDNA擴增進行測序分析主要用于微生物群落多樣性和構成的分析，目前的生物信息學分析也可以基于16s rDNA的測序對微生物群落的基因構成和代謝途徑進行預測分析，大大拓展了我們對于環境微生物的微生態認知。
譜領生物可根據16s的測序數據結果結合已有知識將微生物群落分類到種（species）甚至對亞種級別并進行分析。
]服務優勢
◆專業嚴謹的服務：專業成熟的樣本制備、建庫以及數據分析流程，客觀還原樣品本身的菌群結構以及豐度。
◆覆蓋范圍廣：可覆蓋更廣的可變區，物種注釋時的準確度和靈敏度更高。
◆強大的樣本處理能力：針對大量的樣本以及分組復雜的樣本，具有清晰的邏輯處理思路，專業的分組對比分析能力。
◆定制化分析策略：針對客戶的不同研究需求提供靈活多變的研究方案。針對客戶提出的個性化分析需求，提供專業的分析服務。可定制化分析ROC曲線、Source Tracker分析、Mantel test分析等。
◆完善的售前、售后服務：經驗豐富的技術支持和生物信息工程師提供研究策略指導及完善的售后服務。
]服務項目
宏基因組測序
宏轉錄組測序
細菌基因組de novo測序
真菌基因組de novo測序
16S/18S/ITS擴增子測序
微生物組重測序
]服務流程
]樣本量要求
樣本類型 | 樣本量及樣本要求 |
DNA樣本 | DNA總量≥250ng 樣本濃度≥5ng/uL 樣品純度OD260/280為1.8~2.2 DNA主帶清晰無明顯降解 |
檢測平臺：采用 Ion S5 XL 測序平臺和 NovaSeq 6000 測序平臺。NovaSeq 6000 測序平臺通量更高，速度更快，運行時間更短，周期最短可達10天。Ion S5 XL測序平臺單端測序，無需拼接，SE400/SE600 兩種模式。兩種平臺，為擴增子測序提供更多的選擇。
測序深度：PE 250 / SE400/600
服務周期：10個工作日
]服務內容
OTU分類/Venn圖分析、Alpha多樣性分析、分類組成分析、Beta多樣性分析、菌群組成交互可視化分析、PICRUSt（KEGG/COG/Rfam）菌群代謝功能預測。
從不同分類層級的相對豐度表出發，選取出在各樣品（組）中的最大相對豐度排名前 10 的物種，并將其余的物種設置為 Others，繪制出各樣品對應的物種注釋結果在不同分類層級上的相對豐度柱形圖。
圖1 物種相對豐度柱形圖
從不同分類層級的相對豐度表出發，選取豐度排名前 35 的屬及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從物種層面進行聚類，便于結果展示和信息發現，從而找出樣品中聚集較多的物種。
圖2 基因數目及豐度聚類熱圖
稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，統計它們所代表物種數目（即OTUs數目），以抽取的測序數據量與對應的物種數來構建曲線。稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量接近合理，更多的數據量只會產生少量新的物種（OTUs）。
圖3 稀釋曲線
Alpha Diversity 用于分析樣本內（Within-community）的微生物群落多樣性，通過單樣本的多樣性分析（Alpha 多樣性）可以反映樣本內的微生物群落的豐富度和多樣性，包括用物種累積箱形圖、物種多樣性曲線和一系列統計學分析指數來評估各樣本中微生物群落的物種豐富度和多樣性的差異。
圖4 物種累積箱形圖
Beta Diversity是對不同樣本的微生物群落構成進行比較分析。首先根據所有樣本的物種注釋結果和OTUs的豐度信息，將相同分類的OTUs信息合并處理得到物種豐度信息表（Profiling Table）。同時利用OTUs之間的系統發生關系，進一步計算Unifrac距離（Unweighted Unifrac）。
圖5 Beta多樣性指數熱圖
LEfSe(LDA Effect Size)是一種用于發現和解釋高維度生物標識（基因、通路和分類單元）的分析工具，可以用于進行兩個或多個分組的比較，它強調統計意義和生物相關性，能夠在組與組之間尋找具有統計學差異的Biomarker。讓研究人員能夠識別不同豐度的特征以及相關聯的類別。LEfSe的統計結果包括三部分，分別是LDA值分布柱狀圖，進化分支圖（系統發育分布）和組間具有統計學差異的Biomarker在不同組中豐度比較圖。
圖6 LDA值分布柱狀圖 圖7 進化分支圖
CCA/RDA分析主要用來反映菌群與環境因子之間的關系，可以檢測環境因子、樣本、菌群三者之間的關系或者兩兩之間的關系，可得到影響樣本分布的重要環境驅動因子。
圖8 CCA分析圖
相關文獻
Perruzza L, Gargari G, Proietti M, et al. T Follicular Helper Cells Promote a Beneficial Gut Ecosystem for Host Metabolic Homeostasis by Sensing Microbiota-Derived Extracellular ATP. Cell Rep. 2017;18(11):2566-2575.
