研究背景

越來越多的證據表明，抗生素(Abx)在停用后對腸道微生物群的延遲作用不如其對宿主代謝的直接作用有利。然而，目前還不清楚不同的Abx依賴代謝效應如何影響糖尿病患者，以及腸道微生物群是如何參與其中的。在這里，該研究用Abx雞尾酒治療db/db小鼠12天，停藥24天。我們發現db/db小鼠在Abx治療后體重和血糖下降，在Abx停止后迅速恢復。Abx停藥24天后，db/db小鼠的血漿、肝臟總膽固醇(TC)水平和肝臟重量均升高。

分子生物學研究表明，肝內膽固醇BA合成受到抑制，細胞內膽固醇轉運受阻，膽汁排泄受阻，均與肝臟TC積累有關。腸道微生物群組成的改變、微生物代謝物譜和宿主表型之間的關系表明，存在腸道微生物群相關的機制，介導Abx對db/db小鼠膽固醇代謝的不利延遲效應。因此，我們呼吁在糖尿病動物模型中應用Abx來研究微生物與宿主的相互作用，以及在2型糖尿病患者中應用Abx來預防慢性心血管后果時要謹慎。譜領生物提供此文核心膽汁酸與短鏈脂肪酸絕對定量檢測服務。

模型構建

這篇研究篇幅較長 ，讓小編先為大家簡單的介紹一下實驗設計， 針對此項目研究團隊構造4種實驗模型， 小鼠購買后隨機分為對照組(Veh)和抗生素組(Abx)

p-Veh組:再用飲用水喂養24D ；p-Abx組：抗生素治療12D，再過24D安樂死；Veh組:用飲用水作為喂養12D；

Abx組:含氨芐青霉素(1 g / L),新霉素(1 g / L),鏈霉素(1 g / L)和強力霉素(1 g / L)的飲用水抗生素治療12D；

實驗方法

葡萄糖和胰島素耐受性試驗

小鼠在禁食一晚后接受口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。口服葡萄糖溶液，劑量為2 mg/g(體重/體重)。分別于葡萄糖灌胃后0、15和30分鐘，取眼眶靜脈叢的血。血漿在4℃時立即離心分離，80℃時保存，待進一步分析。

胰島素耐受性試驗(ITT)小鼠禁食6小時后腹腔注射人胰島素2 IU/kg體重。分別于注射后0、15、30、60分鐘用尾出血法測定血糖。

身體成分(脂肪質量和瘦肉質量)

由動物全身成分分析儀(EchoMRI 100H, Houston, TX, USA)根據制造商說明書進行評估。安樂死前，所有小鼠禁食一晚，用10%水合氯醛麻醉。在含有EDTA-Na +和DPPIV抑制劑的試管中收集血液。肝、腸、膜外白色脂肪組織解剖稱重，液氮冷凍，80℃保存，進一步分析。

實時熒光定量PCR檢測

采用TRIzol試劑(Invitrogen)按照制造商要求提取組織總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計定量，1ug RNA用逆轉錄系統試劑盒(Promega)對cDNA進行逆轉錄。使用SYBR Green II Master (Takara)對LightCycler 480 (Roche Applied Science)進行實時PCR擴增和檢測。

蛋白免疫印跡實驗

采用RIPA緩沖液(Cell Signaling Technology)在組織處理器中提取組織蛋白，使用Pierce BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo Scientific)根據制造商說明進行定量。

膽固醇和甘油三酯的測量

血漿甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)的采用比色法試劑盒(Biovision) 根據制造商說明測定。肝臟脂質測定采用Folch溶液(氯仿/甲醇，2:1，v/v)均質化肝臟組織，組織裂解液和血漿樣品按照制造商說明書使用TC和TGs比色試劑盒(Biovision)進行比色酶分析。

腸道菌群代謝物檢測

從血漿、糞便和肝臟中提取BAs，采用超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)進行分析。從盲腸樣品中提取SCFAs，使用氣相質譜Agilent 7890A/ 5975C進行GC-MS代謝組學分析。

腸道微生物群16S rRNA基因測序

如前所述，從冷凍糞便中提取DNA 。設定PCR擴增細菌16S核糖體RNA基因的v3-v4區。使用引物41F 5’-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和另一種引物 806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’組合，熔融溫度為56℃，PCR周期為30，其中條形碼為每個樣品特有的8堿基序列, 將分類等級劃分為操作單元分類法(OTU)代表性序列。刪除未分配的OTUs和未分配給目標物種的OTUs。過濾后的OTU用于下游處理。最后，根據OTU和分類等級對不同種屬的篩選進行了分析。

結論

抗生素對db/db小鼠代謝表型的短暫而持久的影響

6周大的雄性db/db小鼠接受了12天的Abx混合物治療，并在24天內結束。Abx治療后12天，與Veh治療組相比，BW呈下降趨勢，隨機血糖(BG)明顯降低。經過12天的Abx處理后，Veh組的BW增益和BG增量明顯大于Abx組。所有這些差異在Abx停藥后24天就消失了，而Abx停藥后，Abx預處理組(p-Abx)的總BW增加量明顯高于對照組(p-Veh)。

具體變化見如圖1肥胖和糖尿病相關的變化所示：

圖1 肥胖和糖尿病相關的變化

抗生素對db/db小鼠腸道菌群組成短暫而持久的影響

通過16S rRNA基因擴增子測序，分析糞便微生物群組成的變化。主成分分析(PCA)在OTU水平上清楚地分離了Abx處理和Abx停藥處理的小鼠，Abx治療后能大大改變了微生物群組成和微生物的直接響應，但還是直方圖的類屬水平表明，Abx顯著治療組。Abx處理后，Firmicutes和Proteobacteria的相對豐度(RAs)均顯著增加，Bacteroidetes和Deferribacteraceae 的相對豐度(RAs)下降。停藥24天后，上述菌群分類學變化大部分逆轉，但p-Abx組擬桿菌門和厚壁菌門不能恢復到對照水平。

圖2 抗生素治療對腸道微生物群組成的短暫而持久的影響

 抗生素對腸道菌群主要代謝產物的暫時性和長期性影響

接下來分析了Abx對微生物代謝產物、BAs和SCFAs的長期影響。我們首先測定并量化了Abx提取前后不同處理組中Bas含量。雖然血漿和糞便中BA總量的變化不顯著，但Abx停藥后和p-Abx組BA組分的清晰分離，且比較了p-Abx和p-Veh小鼠盲腸樣品中的SCFAs水平。SCFAs檢測結果表明，p-Abx與p-Veh相比，總含量無明顯變化，乙酸和丁酸鹽水平也無明顯變化。然而，p-Abx組丙酸和纈氨酸水平顯著降低。

圖3 抗生素治療對糞便和血漿膽汁酸(BAs)組成的短暫而持久的影響

總結

綜上所述，此文研究首次報道了Abx治療的延遲或長期效果可以增加db/db小鼠的膽固醇水平。我們發現，腸道BAs、奇數SCFAs和腸道菌群組成的改變，提示了細菌-宿主相互作用的途徑，Abx的延遲介導效應，阻礙T2D中宿主肝臟膽固醇的排放。

參考文獻：The delayed effects of antibiotics in type 2diabetes, friend or foe? Journal of Endocrinology |doi.org/10.1530/JOE-17-0709|