Nature Protocols丨高分辨率的13C代謝流分析
在代謝工程、微生物學、生物技術和細胞培養的研究領域中，對于生物系統中代謝途徑流量的精確化計算是非常重要的。13C代謝流分析（13C-MFA）是測定細胞內代謝物流量的主要技術。本文提出了一個關于13C-MFA的方案，包含平行標記實驗、同位素標記測量、統計分析和最佳實驗設計。該方案是基于用13C標記的葡萄糖示蹤劑來培養在兩個（或更多）平行培養基中生長的微生物，然后用氣相色譜-質譜（GC-MS）來檢測氨基酸、糖原結合葡萄糖和RNA結合核糖的同位素標記情況。然后利用Metran等13C-MFA軟件對代謝流量進行估算，進而進行綜合統計分析，確定擬合度并計算流量的置信區間。該方案用時時間短、準確性高，與以往的方法相比有了很大的改進。本次研究是以大腸桿菌ΔtpiA為研究對象，進行了完整的代謝模型建立、流量測定及統計分析，為逐步解決復雜的代謝流量計算提供了參考，并且驗證該方法在原核和真核生物中均可應用。
在基礎和應用生物科學研究中，檢測和量化生物化學途徑中相關代謝物的代謝流量是具有重要意義的。因為代謝流量代表了細胞代謝的綜合能力和功能狀態，可以為從微生物到哺乳動物的生物學發展提供關鍵的可視性證據，并為代謝工程和疾病治療工作提供相關信息。目前使用較多的是穩定同位素標記的方法，并且13C-MFA已經成為最主流的方法。這個方案參考20多年的方法開發，并結合了一些最近的重要發現和創新，改進了以前方法的局限性，包括嚴格的實驗設計，平行標記實驗的綜合分析，綜合統計分析，以及新的同位素標記測定，為高分辨率流量測定增加了巨大的研究價值。
目前用于定量或預測生物系統中代謝流量的替代方法有很多，包括經典的無示蹤實驗的MFA方法、流量平衡分析（FBA）和COBRA方法。這些方法通常需要較少的實驗信息，即不需要13C標記數據。但是，為了測定代謝流量，必須應用各種建模假設（比如最大生長速率和能量生成模型），并且需要各種代謝模型簡化（比如去除無用的代謝循環）。
2020年10月，來自美國特拉華大學化學與生物分子工程系代謝工程與系統生物學實驗室的Christopher P. Long教授及其團隊在Nature Protocols在線發表了High-resolution 13C metabolic flux analysis的文章，在這項研究中作者提出了一個全面的方案，描述了代謝流量研究中的所有相關的步驟，以確保準確的量化代謝流量。而且這個方案在原核和真核生物中都能得到很好的應用。
圖1 高分辨率13C
上圖總結了高分辨率13C-MFA的工作流程，第一步就是設計最佳的示蹤實驗，以確保流量的足夠分辨率。更為重要的是，標記實驗的物質含量和估算流量的精度在很大層面上取決于示蹤劑的選擇，如果選擇不合適，會直接限制精確解析代謝流量的能力。比如對于一個典型的原核生物的代謝網絡，在平行實驗中使用[1,2-13C]葡萄糖和[1,6-13C]葡萄糖示蹤劑的組合，然后對組合數據進行綜合分析則可以獲得最全面代謝流量數據。
標記實驗：13C-MFA實驗實施依賴于設計標記實驗時應考慮的一些固有建模假設。比如示蹤劑實驗應以代謝保持在代謝穩定狀態（即，代謝流量恒定）方式進行。當達到同位素穩定狀態時，應當收集樣本檢測標記的同位素（即，代謝物標記完全穩定）。對于連續的培養物，通過分批培養至少5次來確保代謝穩定狀態。在分批培養中，取樣最好是在早期的指數生長階段進行，因為當葡萄糖接近耗盡時，通常會觀察到復雜的代謝變化，例如醋酸鹽積累到較高水平（如下圖2所示）。
圖2 批量培養以評估葡萄糖的變化
同位素標記和外部速率測量：示蹤劑實驗期間收集的樣品，外部速率（即底物攝取速率、產物分泌速率和生長速率）均被量化。在本研究方案中，通過GC-MS測定標記葡萄糖（步驟 12-16）、蛋白質結合氨基酸（步驟 7-11）、糖原結合葡萄糖和 RNA 結合核糖中的同位素標記。其它的代謝物標記信息可從脂肪酸和細胞內代謝物的分析中獲得。外部速率需要至少一個絕對外部速率（例如底物攝取速率）來確定絕對代謝流量（如下圖3所示）。
圖3 同位素氣相色譜-質譜 (GC-MS) 分析的實驗程序
代謝模型：標記測量所適用的代謝網絡模型應當包括所有相關反應及其各自的碳原子變化規律。該網絡可以建立在諸如KEGG\Gor BioCyc等數據庫的信息基礎上。比如氨基酸代謝模型必須包括底物攝取、中心碳代謝和氨基酸生物合成途徑?？梢酝ㄟ^直接測量生物量組成，而不是用假定的值。這對于非模式生物尤其重要，因為這些微生物的大分子生物量組成可能與模式微生物存在顯著差異。還有就是13C-MFA模型還必須考慮空氣中CO2的摻入，空氣中CO2可以通過羧化反應稀釋同位素標記。導致最終標記效率的降低。
流量估算：代謝模型、外部流量和代謝物標記測量是流量計算所需的三個基本條件。有幾種軟件平臺可用于13C-MFA，包括Metran、INCA等。這些工具都使用基本代謝物單元框架進行同位素標記計算，具有充分的嚴謹性和較高的計算效率。利用這些程序可以通過觀測和模擬測量之間的差異來量化流量。為了確保達到最佳的全方面的擬合，可以進行迭代擬合，其中流量估算從隨機初始值重新開始多次計算，直到出現一個單一的收斂解。
統計分析：在估算流量后，進行統計分析，以驗證擬合優度并確定流量的置信區間。如果模型足夠且測量值無粗差，則方差加權SSR為χ分布的隨機變量，自由度等于擬合測量值n減去擬合參數p的個數。如果SSR介于χn pT和172 2α=2還需進行額外的統計測試。最后，使用專門的非線性統計分析方法或通過蒙特卡羅模擬計算所有單個流量的置信區間。
圖4 大腸桿菌ΔtpiA案例研究的13C-MFA工作流程演示
另外通過這種示蹤劑的選擇之所以可以提高流量分辨率，是因為在沒有tpiA活性的情況下，只有葡萄糖的1,2號位的C可以轉化到甘油-3-磷酸中去，因此[4,5,6-13C]葡萄糖示蹤劑不會標記甘油-3-磷酸。再進行別的示蹤劑實驗、測量甘油-3-磷酸標記以及將所有三個平行標記實驗與模型擬合之后，獲得了統計上可接受的擬合（SSR=183），對估算流量的檢驗也表明，網絡模型中的所有流量目前都可以高精度確定。
目前，13C-MFA已經被廣泛視為精確測定流量的金標準，為驗證潛在的代謝模型和發現新的代謝反應或者途徑提供了依據。
針對上述案例可以看出，大腸桿菌ΔtpiA的流量圖與野生型大腸桿菌的流量圖明顯不同；例如可以觀察到三羧酸（TCA）循環流量增加，氧化磷酸戊糖途徑流量減少，以及潛在途徑的激活，如乙醛酸分流和從草酰乙酸到磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的回流。這些量化了在大腸桿菌ΔtpiA中發生的全局代謝流量重組，以補償關鍵糖酵解酶磷酸三糖異構酶的損失。
Christopher P. Long,et al. High-resolution 13C metabolic flux analysis.Nature Protocols. (2019)2856–2877.
