代謝組學常見問題(二):儀器理論篇
01
代謝組學主要檢測平臺有哪些,如何選擇?
主流的代謝組學檢測平臺有以下三類:
GC-MS(Gas Chromatography and Mass Spectrometry,氣相色譜質譜聯用)、LC-MS(Liquid Chromatography Coupled Mass Spectroscopy,液相色譜質譜聯用)和NMR(Nuclear Magnetic Resonance,核磁共振)(下文均使用英文縮寫)。
所有的樣品類型都可以用這三類平臺檢測,但近些年,由于GC-MS和LC-MS的靈敏度高、特異性強和檢測的范圍廣的特點,越來越多使用這兩類平臺。
02
不同的代謝組學平臺各自優缺點是什么?
概括如下圖:
03
為什么使用GC-MS檢測樣品,卻很少檢測到揮發性的物質?
GC-MS只是一種儀器平臺,針對該平臺,還需要根據不同的檢測要求選擇相應的樣本制備方法和檢測方法。常規的GC-MS代謝組學方法主要采用硅烷化試劑對含活性基團如氨基、羧基、羥基、巰基和磷酸基團等的代謝物進行衍生,提高揮發性和熱穩定性,從而實驗對這些生理上重要的代謝物進行同時檢測。而本身就具有揮發性的代謝物因沸點太低以及極性太強而導致不能被檢測到。
如果關注揮發性的物質,請選擇譜領生物的揮發性物質GC-MS非靶向代謝組檢測產品。
04
為什么有的物質正離子模式下存在,負離子模式下不存在?
質譜端檢測器的本質是電場或磁場,待測物質需要離子化(帶電)才能進入質譜而從被有效檢測。常見的活性基團如氨基易于獲得質子如氫從而帶正電荷,在正離子模式下檢測;羧基、羥基和磷酸基團則易于失去質子從而帶負電荷,常在負離子模式下檢測;而既含氨基又含羧基、羥基或和磷酸基團的代謝物則既可在正離子模式下檢測也可以在負離子模式下檢測。因此,非靶向代謝組學檢測通常需要既檢測正離子模式又需要檢測負離子模式,即通常需要檢測兩次。其次,這也和分析物的性質是有關系的,有的物質容易帶正電荷,有的物質容易帶負電荷。比如說堿性化合物易帶正電荷,加合質子或其他正電荷離子;酸性化合物易帶負電荷,失去質子或加合其他負電荷離子。
05
色譜質譜串聯的優勢是什么?
相較于傳統檢測器,使用靈敏度更高、分辨率更高、定性能力更強的質譜儀代替了光學檢測器。將色譜的分離能力和質譜的分辨、定性能力強強聯合,可以同時對更多、含量更低的物質進行準確檢測,復雜組分中多物質檢測的單位時間也大大縮短。
06
GC-MS能檢測到有機酸、氨基酸、單糖、糖醇、胺類、脂肪酸、吲哚、單甘油酯、核苷、二糖、生育酚、甾醇等代謝物。
07
GC的流動相(載氣)為氣體(通常為高純氦或者氫),這就要求被分析物必須能夠氣化,而生物樣本中很多內源性代謝物都含有極性基團,具有沸點高、不易氣化特點或者高溫下容易降解。衍生化能夠降低這些代謝物的沸點,增加它們的熱穩定性,以便分析能夠順利進行。
衍生化方法及試劑種類繁多,根據不同的分析目標,需選擇合適的衍生化方法。如分析脂肪酸,可采用甲酯化衍生。在GC-MS代謝平臺上,最常用的衍生化方法是硅烷化衍生,因為它的廣譜高效。在進行硅烷化衍生之前,還需對含羰基或醛基的代謝物進行肟化衍生,減少糖類副產物的生成。
08
參考問題1可知,限制LC-MS能力的主要是色譜分離??偨Y歸類為脂質、膽汁酸、氨基酸、核苷酸等多數物質都可以使用LC-MS檢測。
09
GC-MS和LC-MS兩種平臺各有優缺點。GC-MS平臺對單糖、二糖、糖醇、有機酸(含三羧酸循環代謝物以及糖酵解中乳酸、丙酮酸)等代謝物檢測具有極其優秀的色譜分離和定量穩定性優勢,但是對分子量非常大或沸點非常高的代謝物往往無能為力,如脂質、?;鈮A和酰基輔酶A就無法用GC-MS平臺檢測。
LC-MS平臺本質上是性能非常強大的平臺,只要樣本制備方法和檢測方法合適,該平臺幾乎能對所有物質進行檢測,但需要高超的技術和多種方法配合使用。從覆蓋面和經濟性角度考慮,建議2種平臺組合使用,否則需要根據自己的研究目的來選擇。一般來說,對單糖、糖醇、中心代謝途徑密切相關的代謝物、氨基酸、膽固醇比較關注的項目建議選擇GC-MS平臺或者譜領生物公司特色的HILIC-MS平臺,而脂質組學、膽汁酸、?;鈮A、?;o酶A、植物激素、動物類固醇激素等則選擇LC-MS平臺。對于測試平臺的選擇需要考慮的因素較多,也可以聯系譜領生物技術支持獲取更加準確的信息。
END
下一節,我們繼續講解代謝組學樣本收集相關的基礎知識。