Nat Metab丨氧化鳥氨酸代謝支持非炎癥性艱難梭菌的腸道無癥狀攜帶
艱難梭菌（Clostridioides?difficile, Cd）是一種毒素介導的感染的主要腸道病原菌，它造成美國每年超過20萬例住院和1.3萬例死亡。Cd長期以無癥狀攜帶方式持續定殖于人類腸道，并且可能是傳播Cd感染的儲存庫。因此，闡明Cd在無疾病狀態下持續存在的分子機制對于理解發病機制和制定精細的治療策略是十分必要的。該項工作通過腸道菌群宏轉錄組學分析，發現對Cd感染和炎癥抵抗的小鼠表現出菌群水平精氨酸和鳥氨酸代謝途徑的高表達。為了弄清楚Cd代謝，該研究對兩種野生型Cd菌株（630和R20291）及其同基因毒素缺陷突變株感染的悉生小鼠腸道菌群進行RNA測序，發現編碼氧化鳥氨酸降解的單操縱子在非產毒Cd菌株中始終上調。進一步采用基于GC-MS的非靶向代謝組學和基于LC-MS的靶向代謝組學技術，并與細菌和宿主遺傳學相結合，證明膳食和宿主來源的鳥氨酸為Cd定殖提供了競爭優勢，提示Cd在非炎癥的健康腸道內持續存在的機制。
腸道病原菌艱難梭菌（Cd）是一種導致腸道感染的梭狀芽孢桿菌，主要通過分泌大量糖基化毒素蛋白而引起疾病，它是世界范圍導致醫院腹瀉的主要原因。在易感宿主中，感染可導致中毒性巨結腸或死亡。Cd長期以無癥狀攜帶方式持續定殖于人類腸道，如高達71%嬰兒和15%健康成人可能無癥狀攜帶毒性Cd菌株。無癥狀攜帶可能是傳播Cd感染的重要儲存庫。因此，闡明Cd無癥狀攜帶的分子機制對于理解發病機制和制定精細的治療策略是十分必要的。更好地了解非炎癥（穩態）與炎癥（由毒素產生）條件下的Cd代謝行為將更好地為解決和預防疾病進展提供信息。
1. 鳥氨酸氧化降解代謝在非炎癥Cd感染組高表達
首先對腹瀉病人提供的糞便樣本進行菌群測序，根據癥狀和微生物組成，分為外表健康（healthy-like）樣本和菌群失調類樣本。然后建立臨床相關小鼠模型。對來自于healthy-like糞便樣本定殖小鼠（外表健康人源化小鼠）和菌落失調供體糞便樣本定殖小鼠（菌群失調人源化小鼠）的盲腸菌群宏轉錄組通路表達數目進行比較，發現數百條通路發生了顯著變化（菌群失調人源化小鼠富集到82個途徑，外表健康人源化小鼠富集到219個途徑），其中外表健康人源化小鼠富集到28條與氨基酸代謝相關途徑，而菌群失調人源化小鼠僅富集到6個氨基酸代謝途徑。外表健康人源化小鼠的腸道菌群水平上與精氨酸、鳥氨酸和多胺代謝相關的幾條途徑高表達（圖1b）。這些相互關聯的代謝途徑是令人感興趣的，因為精氨酸和鳥氨酸代謝為多胺，通過增加緊密連接蛋白的表達來增強腸道屏障功能，減少免疫細胞的炎癥反應。用艱難梭菌（Cd）感染healthy-like人源化小鼠，發現其中6條菌群氨基酸代謝相關通路仍保持高表達（圖1c）。然而，Cd感染的菌群失調人源化小鼠的腸道菌群中未富集到精氨酸、鳥氨酸和多胺代謝相關通路（圖1c）。這些結果說明，菌群氨基酸代謝在增強宿主屏障功能方面具有潛力，并在受到Cd攻擊時維持腸道處于非炎癥狀態方面發揮作用。
隨后，研究人員采用同基因突變株即毒素擁有Cd（630 WT）或毒素缺乏Cd（630 Tox-）感染悉生小鼠（gnotobiotic mice）。630 WT誘導的病理學特征顯著多于630 Tox-定殖小鼠（與未感染的對照組無差異）。比較630 WT與R20291（產生第三種毒素的超毒力菌株），發現R20291 WT比630 WT誘導更大的整體組織損傷（圖2a）和更多的炎性細胞浸潤（圖2b）。WT Cd感染獲得比毒素缺乏Cd感染更高的Cd相對豐度（擴展圖1b）。因此，Cd產生的毒素對宿主造成更嚴重的組織損傷、炎癥并賦予Cd體內競爭優勢。
接下來對感染R20291WT、R20291 Tox-或未感染的對照小鼠的盲腸內容物進行非靶向代謝組學分析。腸腔代謝物可以對產毒素Cd感染組（WT）、毒素缺乏Cd感染組（Tox-）或未感染組（Ctrl）這三組進行區分（擴展圖1c）。幾種氨基酸及其細菌代謝產物如鳥氨酸（Ornithine）、腐胺（Putrescine，微生物鳥氨酸代謝的一種產物）和瓜氨酸（Citrulline，潛在的前體）在感染后發生了顯著改變（擴展圖2a，2b）。5-氨基戊酸是鳥氨酸和/或脯氨酸的一種還原產物，在無毒素誘導炎癥組（Tox-）更高（擴展圖2b）。代謝組學數據結合易感或抗性人源化小鼠的菌群水平轉錄途徑分析表明，在沒有Cd感染誘導炎癥條件下（即Tox-感染或未感染），精氨酸、鳥氨酸和腐胺代謝途徑更具活性。
為了檢測Cd本身的代謝行為，研究人員對感染WT（630或R20291）、Tox? (630或R20291) 或未感染的對照組小鼠5天的盲腸內容物進行RNA-Seq分析。R20291與630相比產生更多的毒素，引起更大程度組織損傷（圖2a）和增加的炎性細胞浸潤（圖2b），表現出比630更大程度的差異基因表達（圖2c）。毒素缺乏Cd感染（Tox-）比產毒素Cd感染表達更高的氧化性L-鳥氨酸降解途徑（圖2e），表明該途徑支持非炎癥腸道中的Cd代謝?！緹o炎癥Cd感染的腸道菌群RNA-Seq分析表明氧化性L-鳥氨酸降解途徑高表達】
圖1 CDI易感宿主的群落氨基酸代謝途徑不同
圖2 假定的 l-鳥氨酸氧化降解位點在非炎癥環境中 Cd 代謝的無菌模型中始終存在差異表達
擴展數據圖1 Cd 毒素產生在體內具有優勢并產生獨特的代謝組
擴展數據圖2 非靶向代謝組學顯示腸腔內代謝物的毒素依賴性變化
2. 鳥氨酸的膳食來源
外源補加L-鳥氨酸增加了體外培養的艱難梭菌（Cd）R20291和630生長量（擴展圖3b，c）。在氨基酸基本培養基中，與野生型Cd（WT Cd）相比，鳥氨酸氧化降解缺失突變株?oraSE和來自于精氨酸/瓜氨酸合成鳥氨酸的缺失突變株?argF在24h后遭受競爭劣勢?，但是參與谷氨酰胺/谷氨酸和鳥氨酸相互轉化的?argM缺失突變株卻沒有改變（擴展圖3a，3d）。對于增加菌體生長密度來說，鳥氨酸氧化降解和來自于精氨酸/瓜氨酸的鳥氨酸生物合成比來自于谷氨酰胺/谷氨酸的鳥氨酸生物合成更為重要。外源添加鳥氨酸增加了WT對?oraSE的優勢，而精氨酸則沒有影響（擴展圖3e），表明從環境攝取鳥氨酸具有潛在適應性優勢，而不是來自Cd自身代謝。在豐富培養基中，WT和?oraSE組Cd生長量達到相同的最大光密度，補加L-鳥氨酸可促進WT而不是?oraSE的生長（擴展圖3f）。采用含WT或?oraSE的一組特定細菌感染悉生小鼠，發現鳥氨酸氨基變位酶（ornithine aminomutase）缺失突變株上調表達鳥氨酸氧化降解相關基因（orr，ord和ortB），而鳥氨酸還原途徑（cyclodeaminase、prdF和prdD）以及參與鳥氨酸與瓜氨酸/精氨酸（argF）或谷氨酸/谷氨酰胺（argM）相互轉化的基因不受影響（擴展圖3g），說明鳥氨酸氨基變位酶缺失影響體內鳥氨酸氧化代謝途徑。
研究者比較了標準嚙齒動物膳食（含有鳥氨酸）或鳥氨酸缺乏膳食喂養的WT Cd定殖小鼠的轉錄譜，發現氧化鳥氨酸降解相關基因是不同膳食條件之間的最大差異基因。當膳食存在鳥氨酸時，參與鳥氨酸氧化代謝的基因表達更高（圖3a）。為了確定鳥氨酸降解是否賦予Cd體內適應性優勢，將常規腸道菌群定殖小鼠與等量WT Cd和?oraSE Cd共感染。當飼喂常規小鼠標準飲食(含鳥氨酸)時，鳥氨酸降解賦予WT Cd的宿主體內適應性優勢勝過?oraSE突變株，而完全不含鳥氨酸的膳食則無差異（圖3b）。當飼喂不含鳥氨酸膳食時，如果提供含1%（w/v）L-鳥氨酸的飲水，WT Cd展現了針對?oraSE的競爭優勢；當缺乏膳食鳥氨酸時，WT Cd小鼠沒有勝過? oraSE Cd（圖3c），說明鳥氨酸本身提供WT Cd超過?oraSE Cd的競爭優勢。因此，膳食鳥氨酸影響Cd代謝。
當給WT或?oraSE Cd感染的悉生小鼠飼喂無鳥氨酸飲食并補充含鳥氨酸飲用水后，WT感染小鼠比?oraSE感染小鼠獲得顯著更高豐度的Cd定殖（圖3d）。對于復雜菌群常規小鼠，當喂食無鳥氨酸飲食并補充含鳥氨酸的飲用水后，盲腸內容物獲得更高的總Cd豐度（擴展圖4a）。當飼喂標準飲食并提供含鳥氨酸飲用水后，WT組糞便（擴展數據圖4b）和盲腸內容物（擴展數據圖4c）獲得更高的Cd定殖絕對豐度。說明膳食鳥氨酸促進了Cd的定殖水平。
對于悉生小鼠和常規小鼠，?oraSE Cd感染后的豐度雖然顯著低于WT（圖3d），但是其誘導的血清脂質運載蛋白-2（宿主炎癥指標）水平卻顯著高于WT組（圖3e, 3f），但毒素含量無顯著差異（擴展圖4d）。膳食鳥氨酸補充劑本身不改變血清脂質運載蛋白-2（擴展圖4e）。數據表明?oraSE Cd菌株本身代謝引起宿主炎癥反應，而WT Cd的正常代謝鳥氨酸的能力導致較少炎癥。因此，Cd鳥氨酸代謝有助于改善宿主炎癥狀態。
擴展數據圖3 Cd鳥氨酸降解和生物合成途徑
圖3 飲食中鳥氨酸的代謝對Cd具有競爭優勢，并可減少宿主炎癥。
擴展數據圖4 膳食鳥氨酸可提高小鼠腸道中的Cd豐度
3. 鳥氨酸的宿主來源
鳥氨酸在哺乳動物免疫代謝中起重要作用。精氨酸酶將精氨酸分解成鳥氨酸，鳥氨酸是亞精胺，精胺和腐胺等多胺類物質的前體（擴展圖5a）。作者假設，當沒有毒素誘導的炎癥（Tox?)時，Cd可利用宿主來源的鳥氨酸。為了確定宿主可誘導的一氧化氮合酶（iNOS）或精氨酸酶是否對Cd感染有反應，我們對常規小鼠進行標準抗生素預處理（每只小鼠灌胃1?mg克林霉素）和隨后的WT Cd感染。與未感染的抗生素處理對照組相比，WT Cd感染小鼠遭受顯著更高的組織損傷和炎性細胞浸潤（圖4a）。一氧化氮合酶（iNOS）也利用精氨酸作為活性氧爆發期間NO?產生的底物。精氨酸酶活性被描述為2型炎癥反應標志，特別是巨噬細胞。WT Cd感染引起小鼠結腸組織Nos2（一氧化氮合成酶2基因）上調表達，而Arg1（精氨酸酶1基因）沒有顯著改變（圖4b），表明更少的精氨酸可用于鳥氨酸的生物合成。因此，Cd毒素誘導的宿主炎癥抑制了精氨酸經宿主精氨酸酶轉化為鳥氨酸。
為了增加宿主精氨酸以用于經宿主精氨酸酶的鳥氨酸生物合成，我們感染了Nos2基因敲除小鼠（iNOS?/?)。Cd感染期間，iNOS?/?小鼠糞便鳥氨酸與精氨酸的比值較iNOS+/+小鼠升高（擴展圖5c），且iNOS?/?小鼠糞便鳥氨酸濃度較iNOS+/+小鼠顯著升高（圖4c）。為了解開宿主iNOS和Cd氧化鳥氨酸途徑之間的代謝相互作用，研究者向無鳥氨酸飲食中加入等量WT和?oraSE Cd對iNOS?/?和iNOS+/+小鼠進行共感染。與研究者假設的Cd利用宿主來源的鳥氨酸一致，WT Cd感染比?oraSE Cd感染的iNOS?/?小鼠具有顯著的競爭優勢，而不是iNOS+/+小鼠（圖4e）。Nos2基因型小鼠不影響Cd初始定殖后的豐度變化（擴展圖5d）和全身炎癥（擴展圖5e）。因此，通過iNOS消融增加宿主的鳥氨酸產量，引起Cd氧化鳥氨酸相關基因的表達增加，并提供WT Cd競爭優勢。
隨后，為了確定膳食鳥氨酸的可用性是否影響Cd代謝，研究人員比較了用WT Cd喂養標準嚙齒動物飲食（含有鳥氨酸）或完全定義的缺乏鳥氨酸的飲食的小鼠的轉錄譜。氧化鳥氨酸降解基因座中的基因在飲食條件之間表達差異最大：當存在飲食鳥氨酸時，參與其氧化代謝的基因表達更高。研究人員使用WT或鳥氨酸氧化降解（ΔoraSE）Cd感染常規微生物群定植的小鼠，發現補充膳食鳥氨酸可賦予Cd競爭優勢。
圖4 通過宿主iNOS缺乏產生的鳥氨酸為腸腔中的Cd提供了競爭優勢
擴展數據圖5 通過誘導型一氧化氮合酶進行宿主鳥氨酸代謝
該項工作研究了在沒有疾病癥狀和共生腸道菌群存在下的艱難梭菌（Cd）的持續存在性。雖然我們清楚腸道病原體受益于其毒力因子帶來的生理變化，但是尚不清楚Cd的無癥狀攜帶機制。該項工作采用代謝組學與宏轉錄組學相結合的方法，發現對Cd感染和炎癥抵抗小鼠（無癥狀攜帶）表現出菌群水平精氨酸和鳥氨酸代謝途徑的高表達。由于膳食鳥氨酸或宿主產生的鳥氨酸的存在，Cd氧化降解鳥氨酸的能力具有競爭優勢。這項工作強調了在腸道內穩態條件下宿主免疫代謝和Cd之間的代謝相互作用。了解病原體在沒有疾病的情況下的持久性是邁向預防性治療策略的重要一步。
Pruss KM, Enam F, Battaglioli E, DeFeo M, Diaz OR, Higginbottom SK, Fischer CR, Hryckowian AJ, Van Treuren W, Dodd D, Kashyap P, Sonnenburg JL. Oxidative ornithine metabolism supports non-inflammatory C.?difficile colonization. Nat Metab. 2022 Jan;4(1):19-28.
